細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程，供參考
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

實(shí)驗操作步驟：  公司產(chǎn)品僅用于科研，不得用于臨床．
a．采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動物。    
b．立即在無菌超凈臺內(nèi)用70％乙醇擦洗整個動物。  
c．用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。   
d．用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養(yǎng)皿上。   
e．剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的100ml燒杯中。   
f．漂洗胚胎，去掉PBS。繼續(xù)用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。

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冷凍保存細(xì)胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

實(shí)驗材料： 
1. 50ml 配制好的RPMI1640培養(yǎng)液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶 
2. 100ml滅菌燒杯2個； 
3、50ml離心筒2個 
4、滅菌培養(yǎng)皿1個，細(xì)胞培養(yǎng)瓶1個 
5、1ml ，200μl移液器各1支；槍頭盒2個；無菌玻璃攪拌棒1個 
6、細(xì)胞計數(shù)板1塊； 
7、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把； 
8、酒精燈1臺；
細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：
1.研究的對象是活細(xì)胞
在實(shí)驗過程中，根據(jù)要求可始終保持細(xì)胞活力，并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細(xì)胞的情況，包括活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等。
2.研究條件可以人為控制
pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)的條件，可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行人為的控制，同時，可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進(jìn)行實(shí)驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。
3.研究的樣本可以達(dá)到比較均一性
通過細(xì)胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細(xì)胞系則可以達(dá)到均一性而屬于同一類型的細(xì)胞，需要時，可采用克隆化等方法使細(xì)胞達(dá)到純化。
4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄
采用各種研究技術(shù)：如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記等各種儀器設(shè)備 
記錄方式可采用攝影照片、縮時電影、電視等多種手段。
5.研究的范圍比較廣泛
應(yīng)用的學(xué)科領(lǐng)域較為寬廣，如細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等；
適用的對象范圍廣，從低等動物到高等動物，一種動物的不同年齡階段以及不同組織，都可進(jìn)行有針對性的研究。
6.研究的費(fèi)用相對較經(jīng)濟(jì)
可提供大量、同一時期、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗對象。

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細(xì)胞凍存：
對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行凍存的最佳方法是將細(xì)胞置于含有(DMSO)等冷凍保護(hù)劑的*培養(yǎng)基中于液氮中儲存。冷凍保護(hù)劑可降低培養(yǎng)基的冰點(diǎn)，并可減緩冷卻速度嗎，大大降低冰晶形成的危險  (冰晶可損傷細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡)。
注：DMSO 可促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。操作含DMSO的試劑時，應(yīng)采用與此類物質(zhì)安全危害相適應(yīng)的設(shè)備和操作規(guī)范，并應(yīng)按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處置此類試劑。 
細(xì)胞凍存指導(dǎo)原則
凍存細(xì)胞系以備將來之用時，必須遵守以下原則。與其他細(xì)胞培養(yǎng)操作一樣，我們建議您嚴(yán)格遵守您所用細(xì)胞系附帶的操作說明，以便獲得最佳結(jié)果。 
1）在高細(xì)胞濃度情況下進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的凍存，并且細(xì)胞傳代次數(shù)盡可能少。確保凍存前活細(xì)胞百分比至少為90%。請注意最佳凍存條件取決于所用細(xì)胞系。 
2）細(xì)胞應(yīng)緩慢冷凍，可使用可控制降溫速度的低溫冰箱或者低溫冷凍容器使溫度每分鐘大約降低1°C。
3）必須使用推薦的凍存培養(yǎng)基。凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護(hù)劑
4）將冷凍的細(xì)胞于 -70°C 以下溫度儲存；溫度高于 -50°C 時，冷凍的細(xì)胞將開始變質(zhì)。 
5）必須使用無菌凍存管儲存冷凍的細(xì)胞。裝有冷凍細(xì)胞的凍存管可浸于液氮或者在液氮上方的氣相空間內(nèi)保存 
6）必須穿戴個人防護(hù)設(shè)備。 
7）所有與細(xì)胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術(shù)，并且在層流通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。

實(shí)驗操作：
1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被。試驗前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶，置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無菌），4℃冰箱放置，備用。
2、取材：正常成年大鼠腹腔注射5%麻醉，75%酒精浸泡，無菌條件下迅速取出大鼠主動脈。
3、材料預(yù)處理：將獲取的血管放入含有1% P/S的1 × PBS （pH 7.4 ）中反復(fù)洗滌，去除血管外部的洗滌液澄清，用無菌鑷子剝?nèi)ネ饽っ娴臍埩艚M織。PBS洗滌凈。
4、除去內(nèi)皮細(xì)胞：將血管縱向剪開， 內(nèi)膜面向上，無菌鑷子沿中軸方向反復(fù)刮動內(nèi)膜層4-5遍，去掉內(nèi)皮細(xì)胞，用1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次。
5、分離中膜：將去掉內(nèi)膜的血管，繼續(xù)刮動分離中膜，去掉外膜，用眼科剪將內(nèi)膜剪碎為1×1mm3的小塊，加入1 × PBS （pH 7.4 ），轉(zhuǎn)移到15ml 離心管中，PBS洗滌3次，離心收集沉淀物。
6、消化：在洗凈的內(nèi)膜碎塊中加入消化酶液，將離心管放入37℃水浴消化15min。
7、終止消化：吸出消化液入新的離心管中，按1：1加入消化終止液，中止酶反應(yīng)；余下的組織繼續(xù)加入消化液，消化15min ，重復(fù)消化3次。
8、收集重懸細(xì)胞：收集中止后的消化液于離心管中，1000 rpm，離心10 min，棄去上清，加入培養(yǎng)液重懸，染色計數(shù)細(xì)胞。
9、培養(yǎng)細(xì)胞密度：調(diào)整細(xì)胞密度以5 × 105個/ml 接種入培養(yǎng)瓶。
10、培養(yǎng)：放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。
M4e細(xì)胞，人喉癌細(xì)胞 人腦膠質(zhì)細(xì)胞株(正常),HEB細(xì)胞 中國倉鼠卵巢細(xì)胞(亞系克隆);CHO-HCV-NS5A5′-CDP，2Na5-胞嘧啶核苷二嶙酸二鈉鹽1克BR，99%

Ca Ski(人上皮細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2鄰基本同 2'-Mqthylccqtophqnonq 277-16-

FCAR Others Human 人 FCAR / CD89 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 2-Nonanoll庚基甲基5克CP，98%

tTA基因修飾的小鼠畸胎瘤細(xì)胞(B類);F9-CAG-tTA-3A1L-LYSINEMONOHYDRATEL-賴酸,一水蛋白組學(xué)級500G39665-12-8COLD

HA Others H5N1 甲型流感 H5N1 (A/Hubei/2011) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 17832-28-91，49,4-putene7iol vinyl
小氣道上皮細(xì)胞生長添加物SAEpiCGS脫水長春堿（標(biāo)準(zhǔn)品）Anhydrovinblastine質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥95%，標(biāo)準(zhǔn)品

MIF Others Human 人 MIF / GLIF 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 長春新堿（標(biāo)準(zhǔn)品）Vincristine質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品

CRFK 貓腎上皮細(xì)胞硫酸金雀花堿；硫酸司巴?。?biāo)準(zhǔn)品）Sparteine sulfate質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品

T-111B木瓜蛋白酶(含100mL酶解緩沖液)10mL高烏甲素（標(biāo)準(zhǔn)品）Lappaconitine質(zhì)量規(guī)格：滴定法≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品

HET-1A, 人食管上皮細(xì)胞番茄紅素（標(biāo)準(zhǔn)品）Lycopene質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥90%,標(biāo)準(zhǔn)品,充氮?dú)獗Ｗo(hù)
人卵巢上皮細(xì)胞癌細(xì)胞腦靜脈血管平滑肌細(xì)胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)N-叔丁氧羰基-L-甲硫氨酸BOC-L-Mine質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

RBP4 Others Canine 狗 RBP4 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) BOC-L-絲氨酸N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-serine質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR

大鼠心肌成纖維細(xì)胞*培養(yǎng)基 100mLBOC-L-苯丙氨酸Boc-L-phenylalanine質(zhì)量規(guī)格：>98.5%,BR

35.1雜交瘤細(xì)胞抗CD2 35.1 hybridoma cells against CD2 RPMI-1640(GIBCO)+10%FBSBOC-甘氨酸Boc-Glycine質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

IFNA5 Protein Mouse 重組小鼠 IFNA5 / IFNaG 蛋白 (His 標(biāo)簽)BOC-L-異亮氨酸Boc-Ile-OH質(zhì)量規(guī)格：>98.5%,BR

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
二． 細(xì)胞處理：
1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

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公司細(xì)胞現(xiàn)貨供應(yīng)，質(zhì)量有保證、*、實(shí)驗效果好，我司為您提供免費(fèi)代測服務(wù)，同時提供最新價格、說明書、規(guī)格、用途、實(shí)驗原理等相關(guān)操作說明。公司產(chǎn)品僅用于科研，不得用于臨床．

注意事項：
1.收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。
2.收到細(xì)胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時（視細(xì)胞密度而定）穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收細(xì)胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細(xì)胞在運(yùn)輸過程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行銷售依據(jù)。
3.由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊?，故本公司只保證客戶收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)，故客戶需要售后時需出示收到細(xì)胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。
4.所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。
腺苷酸環(huán)化酶9抗體

細(xì)胞培養(yǎng)方法：
1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；
③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；
④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；
⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；
⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。
2、細(xì)胞復(fù)蘇：
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。
3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種
①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；
③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；
④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

WPMY-1人正常前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞 WPMY-1 of normal human prostate somal immortalized cell DMEM+5%FBSFmoc-D-Leu-OHN-芴甲氧羰基-D-亮酸5克特，99%

VEGFC Protein Human 重組人 VEGF-C 蛋白 (His 標(biāo)簽)溴代烷 Bromoqthcnq

小鼠條紋神經(jīng)細(xì)胞(MN-s)(1×106) 5-8F, 人高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系 Human天狼猩紅 Sirius Rose BB (Standard Fluka, for mi... 2829-43-8 5G 染色劑

豹貓肺成纖維樣細(xì)胞;LCL4DMAPAA二甲基丙基酰胺100毫升BR，98%

GFRA3 Others Mouse 小鼠 GFRA3 / GFR-alpha-3 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) litxiumChloride 100g/500g Amresco分裝
小鼠骨髓瘤細(xì)胞;P3/NSI/1-Ag4-1細(xì)胞弛素BCytochalasin B質(zhì)量規(guī)格：>96%,進(jìn)分

CHI3L1 Others Mouse 小鼠 CHI3L1 / YKL40 / gp39 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 煙曲霉素Fumagillin from Aspergillus fumigatus質(zhì)量規(guī)格：>98%,進(jìn)分

Caco-2 人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞寡霉素BOligomycin B from Streptomyces質(zhì)量規(guī)格：>97%,進(jìn)分

A498-EGFP-puro人腎癌細(xì)胞 Human renal cell carcinoma A498-EGFP-puro cells DMEM+10% FBS+1%P/S+2ug/ml puromycin棒曲霉素Patulin from Penicillium expansum質(zhì)量規(guī)格：>98%,進(jìn)口

GDF15 Protein Human 重組人 GDF-15 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)3-溴二苯甲酮 3-Bromobenzophenone質(zhì)量規(guī)格：>97%,
人口腔上皮癌細(xì)胞皮膚肥大細(xì)胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)D-脯氨酸D-Proline質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

EFNB1 Others Rat 大鼠 Ephrin-B1 / EFNB1 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) D-苯丙氨酸D-Phenylalanine 質(zhì)量規(guī)格：>99%,BR

大鼠腎管狀上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基 100mLD-丙氨酸D-Alanine質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

Y3-Ag 1.2.3大鼠骨髓瘤細(xì)胞 Myeloma cells in Y3-Ag 1.2.3 rats DMEM培養(yǎng)基+10%FBSβ-丙氨酸β-Alanine質(zhì)量規(guī)格：>98%

IGFBP3 Protein Human 重組人 IGFBP3 / IBP3 蛋白 (His 標(biāo)簽)β-丙氨酸(標(biāo)準(zhǔn)品)β-Alanine質(zhì)量規(guī)格：>98%(T),標(biāo)準(zhǔn)品
細(xì)胞接受后的處理：
1） 收到細(xì)胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們。若發(fā)現(xiàn)污染或疑似污染，請及時與我們?nèi)〉寐?lián)系。
2） 請先在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長狀態(tài)，去掉封口膜并將T25瓶置于37℃培養(yǎng)約2-3h。
3） 棄去T25瓶中的培養(yǎng)基，添加6ml新的的*培養(yǎng)基。
4） 如果細(xì)胞長滿（90%以上）請及時進(jìn)行細(xì)胞傳代。
5） 接到細(xì)胞次日，請檢查細(xì)胞是否污染，